راهنمای تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC)

در این مطلب به روش استفاده از آنتی‌بادی های ایمونوهیستوشیمی (IHC) پرداخته و پروتکل و راهنمای این تکنیک را مرحله به مرحله بررسی خواهیم کرد.

       1) مرحله آماده سازی بافت:

آماده سازی نمونه شامل چند مرحله جداگانه می باشد:

فیکس کردن بافت: هدف از فیکساسیون بافت حفظ ساختار سلولی و مورفولوژی بافت ها می باشد. پروسه فیکساسیون بافت طبق مراحل زیر انجام می گیرد.

A) غوطه ور ساختن بافت در پارافین (Paraffin- Embedded- Tissue)

1. در این مرحله باید به کمک فرمالین بافت را فیکس نماییم. بدین ترتیب بافت مورد نظر را به مدت چند ساعت در فرمالین غوطه ور می نماییم (زمان بسته به نوع و ضخامت بافت متغیر می باشد). عمومأ بهترین زمان بین 18 تا 24 ساعت می‌باشد. بعد از فیکس کردن بایستی بافت در پارافین غوطه ور گردد.
2.  به دلیل عدم حلالیت پارافین در آب،. بایستی قبل از غوطه ‌ور کردن بافت در پارافین مرحله آب‌گیری را انجام دهیم. بدین ترتیب از اتانول در دمای اتاق استفاده می‌کنیم. بافت را سه مرتبه هربار به مدت نیم ساعت در اتانول 70%، 90% و 100% قرار می دهیم.
3. بعد از انجام پروسه آب‌گیری باید مواد از روی بافت شسته شوند که برای این کار از Xylene استفاده می‌کنیم. پس از شستشوی اتانول، بافت را در پارافین به مدت 20 دقیقه غوطه ور می‌سازیم و سپس بافت را در معرض سرما قرار می دهیم تا سفت شود. این پروسه معمولا از 20دقیقه تا یک شبانه‌ روز متغیر می باشد. پس از سفت شدن بافت، با استفاده از دستگاه میکروتوم بافت را به قطعات 15-5 میکرومتر برش می‌زنیم.

B) پارافین زدایی

پس ازغوطه ور ساختن بافت ها در پارافین و برش زدن با میکروتوم ، بایستی پارافین را از بافت جدا کنیم، چرا که از این مرحله به بعد به بافت خالص نیاز داریم . برای این کار بافت همراه با پارافین را به لام های شارژ شده دارای بار مثبت منتقل می‌کنیم (وجود بار مثبت سبب تسهیل اتصال بافت به لام می گردد.) پس از چسبیدن بافت به لام بایستی پارافین را از بافت جدا کنیم که نیاز به آبدهی بافت می باشد. مرحله آبدهی برعکس مرحله آبگیری انجام می شود. این مرحله در جوابدهی بسیار مؤثر می باشد.

1. اسلایدها را دو مرتبه هربار به مدت 5 دقیقه در xylene غوطه ور می کنیم تا شسته شود.
2. اسلایدها را در اتانول 50%، %75، 95% و 100%  (هرکدام به مدت 5 دقیقه) غوطه‌ور می کنیم.
3. بافت را با آب استریل و یا بافر شستشو کاملا می‌شوییم.