معرفی تکنیک ایمونوهیستوشیمی

در روش مستقیم، آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن بافت به آنزیم متصل است آنزیم ها در مجاورت با سوبسترا تولید رنگ میکنند که در زیر میکروسکوپ نوری قابل مشاهده است. گاهی به جای آنزیم از رنگ

در روش غیر مستقیم آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن به بافت متصل شده و بعد از آن آنتی بادی ثانویه را اضافه می کنیم که به آنتی بادی اولیه می چسبد  و از طرف دیگر هم به آنزیم کونژوگه است. این کار باعث تقویت رنگ تولید شده توسط سوبسترا می شود.

در آزمایشگاه های تشخیص طبی در بخش پاتولوژی ‍‍‍‍‍‍‍از ایمونوهیستوشیمی به عنوان یکی از راه های اصلی برای بررسی حضور بیومارکرها در بافت به منظور تشخیص سرطان ها مطالعه فرآیند پاتوژنز بیماری‌ها تشخیص ماهیت سلولها و نوع بافت  تعیین اولیه یا متاستاتیک بودن توده موارد پروگنوستیک و اهداف درمانی استفاده می شود. در آزمایشگاه های تحقیقاتی نیز برای بررسی انواع مارکرهای داخل سلولی و خارج سلولی استفاده می شود. در شکل زیر لکه های قهوه ای رنگ سلول های بیان کننده گیرنده استروژن (ER ) هستند که در تشخیص سرطان پستان کاربرد دارد.

آنتی بادی ها مهم ترین جز از سیستم ایمونوهیستوشیمی هستند و به همین دلیل انتخاب آنتی بادی مناسب بسیار حائز اهمیت است. بهتر است که منبع آنتی بادی مورد استفاده یعنی حیوانی که از آن آنتی بادی گرفته شده است با منبع بافتی که روی آن کا ر می شود متفاوت باشد.

آنتی بادی ثانویه  باید بخش FC آنتی بادی اولیه را شناسایی کند. مثلا اگر منبع تهیه آنتی بادی اولیه  موش باشد آنتی بادی ثانویه باید ضد آنتی بادی های موشی باشد (Anti Mouse IgG Antibody).

نمونه های مورد استفاده:

بافت های پارافینه

 بافت های مورد استفاده  برای IHC از افراد متوفی یا زنده جمع آوری می شوند و ممکن است منشأ حیوانی یا انسانی باشند. به محض اینکه روند طبیعی و فرآیندها و کنترلهای  داخل بدن پس از فوت یا برداشتن بافت ، تغییراتی در بافت ایجاد می شود که می تواند اثرات مهمی روی آنتی ژن داشته باشد. شروع زودرس هیپوکسی ، تغییر در pH و آنزیم های لیزوزومی می تواند اثرات بسیار مضر بر حفظ آنتی ژن داشته باشد. مراحل بعدی تخریب شامل تخریب بافت توسط باکتری ها و قارچ ها است که منجر به از دست رفتن ناخالص هر دو آنتی ژن و مورفولوژی سلولی می شود. بنابراین ضروری است که بافتها ، یا به طور خاص آنتی ژن هایی که توسط ایمونوهیستوشیمی نشان داده می شوند ، در حالت داخل بدن تا حد ممکن حفظ شوند. این امر با فرایندی که “تثبیت” نامیده می شود ، حاصل می شود. فیکساتور معمولاً به بافت نفوذ می کند و با ایجاد تغییرات در ساختار سوم پروتئین  آنها را از لحاظ بیولوژیکی غیرفعال می کند. یکی از رایج ترین فیکساتورها فرمالین است. این بافت ها در فرمالین نگهداری می شوند و  پس از مراحل پردازش به منظور حفظ شکل و ساختار آنتی ژن ها در پارافین قالب بندی می شوند. و سپس با دستگاه میکروتوم برش های نازک حدودا 4 میکرومتر تهیه می شود. این نمونه ها را می توان تا چند سال در دمای اتاق نگهداری کرد.

بافت های فریز شده:

این بافت ها بعد از جدا شدن از موجود زنده به سرعت فریز شده و برش داده می شوند. در این روش چون مراحل پردازش بافت وجود ندارد مناسب آنتی ژن هایی است که نسبت به تغییرات محیطی مثل قرار گرفتن  در فرمالین و یا حرارت حساس هستند. در مواردی نیز که سرعت تشخیص اهمیت دارد از این روش استفاده می شود. برای مثال در اتاق های عمل بعد از برداشتن بافت های توموری برای تشخیص سریع مورفولوژی سلول ها ، نوع و grade سرطان ، بررسی مارکرهای متاستازی و… نمونه بیمار را به بخش پاتولوژی می فرستند و در مدت کوتاهی جواب را تحویل می گیرند.

مراحل انجام کار

ابتدا از بافت مورد نظر اسلاید تهیه می کنیم .

پارافین زدایی: اگر از نمونه پارافینه استفاده می کنیم باید ابتدا پارافین زدایی انجام شود.

آبدهی: بعد از آن مرحله آبدهی یا hydration  که با شیب الکل ازغلیظ به رقیق انجام می شود.

بازیابی آنتی ژن: در این مرحله با استفاده از حرارت ساختارهای پیچ و تاب خورده ثانویه آنتی ژن باز می شود و اپی توپ های مورد نظر در دسترس آنتی بادی برای شناسایی قرار خواهند گرفت.

بلاکینگ: قبل از اضافه کردن آنتی بادی به منظور کاهش هر چه بیشتر واکنش های غیر اختصاصی انجام میگیرد.

افزودن آنتی بادی: ابتدا آنتی بادی اولیه را اضافه کرده در صورتی که از روش غیر مستقیم استفاده میکنید بعد از گذراندن زمان انکوباسیون آن را شستشو داده و سپس آنتی بادیه ثانویه را اضافه کنید.

اضافه کردن سوبسترا: سوبسترای مناسب برای آنزیمی که به آنتی بادی متصل است را اضافه میکنیم. مثلا برای آنزیم HRP سوبسترای م.رد استفاده معمولا DAB است.

رنگ زمینه: متناسب با رنگی که توسط سوبسترا تولید شده است از یک رنگ زمینه استفده میکنیم مثلا DAB تولین رنگ قهوه ای میکند و رنگ آمیزی زمینه باید شباهتی با آن نداشته باشد. رنگی مثل هماتوکسیلین که آبی است برای این کار مناسب است مانند شکل زیر که لکه های قهوه ای در اثر اتصال آنتی بادی به آنتی ژن و در نتیجه تولید رنگ توسط سوبسترا است و رنگ آبی هماتوکسیلین به عنوان رنگ زمینه برای تشخیص محدوده بافت استفاده شده است.

آبگیری: بر عکس مرحله آبدهی از یک شیب غلظتی از رقیق به غلیظ استفاده می کنیم. پس از آن در زایلین میگذاریم تا شفافیت و تفکیک بهتری را ببینیم.

مونت کردن: برای دیدن لام زیر میکروسکوپ باید آن را مونت کنیم . برای این کار باید از چسب مخصوص مونت استفاده کنیم سپس روی آن لامل گذاشته و زیر میکروسکوپ بررسی می کنیم.